Base estructural de la absorción de iones en el cobre.

Mar 01, 2024

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5121 (2022) Citar este artículo

2453 Accesos

2 citas

3 altmétrico

Detalles de métricas

El cobre es esencial para las células vivas, pero tóxico en concentraciones elevadas. Las ATPasas de clase 1B tipo P (P1B-) están presentes en todos los reinos de la vida, lo que facilita la exportación celular de metales de transición, incluido el cobre. Las ATPasas de tipo P siguen un mecanismo de acceso alterno, con conformaciones E1 orientadas hacia adentro y E2 orientadas hacia afuera. Sin embargo, no se dispone de información estructural sobre los estados E1 para las P1B-ATPasas, lo que dificulta la comprensión mecanística. Aquí, presentamos estructuras que alcanzan una resolución de 2,7 Å de una P1B-ATPasa específica de cobre en una conformación E1, con datos y análisis complementarios. Nuestros esfuerzos revelan una disposición de dominio que genera espacio para la interacción con chaperonas donadoras de iones y sugieren una transferencia directa de Cu+ al núcleo transmembrana. Una metionina desempeña un papel clave al ayudar a la liberación del ion chaperona unido y formar un sitio de entrada de carga junto con las cisteínas del motivo característico de CPC. En conjunto, los hallazgos proporcionan información sobre el transporte mediado por P1B, que probablemente también se aplique a los miembros humanos de P1B.

El cobre es un metal de transición que ejecuta funciones vitales dentro de las células y, por lo tanto, es un micronutriente esencial para los organismos en todos los reinos de la vida. Su capacidad para realizar un ciclo redox entre estados reducido (Cu+) y oxidado (Cu2+) se explota en una paleta de enzimas clave, por ejemplo, la citocromo c oxidasa o la NADH deshidrogenasa, críticas para procesos metabólicos fundamentales como la respiración celular1. Sin embargo, el cobre intracelular libre puede desencadenar la formación de radicales hidroxilo tóxicos y desplazar otros metales de las proteínas2. En consecuencia, los niveles de cobre intracelular están estrechamente regulados, mediados por numerosos acompañantes, reguladores y proteínas exportadoras dedicadas, en particular las ATPasas tipo P transportadoras de cobre.

Las ATPasas de tipo P comprenden una gran superfamilia que acopla la energía de la hidrólisis del ATP al transporte de carga a través de membranas biológicas. Se subdividen en cinco subfamilias, P1-5, con hasta cuatro subclases, AD, según la identidad de secuencia y la especificidad de transporte3, que abarca desde cationes metálicos hasta fosfolípidos4, poliaminas5 y hélices transmembrana6. La subclase 1B específica de metales de transición (P1B-ATPasas) cataliza la salida de, por ejemplo, Zn2+, Co2+, Fe2+ desde el interior de la celda e incluye miembros específicos de cobre que históricamente se subdividen en P1B-1- (CopA) y P1B-3-. ATPasas (CopB)7,8. Las P1B-ATPasas son abundantes en los procariotas y protegen al organismo del estrés por metales pesados. Dos proteínas CopA están presentes en los humanos, ATP7A y ATP7B. El mal funcionamiento de estos miembros provoca los graves trastornos neurológicos de la enfermedad de Menkes y de Wilson, respectivamente9,10.

Las ATPasas de tipo P comparten una arquitectura general común que consta de tres dominios citosólicos (actuador (A-), fosforilación (P-) y unión de nucleótidos (N-), junto con un dominio que atraviesa la membrana (M-) compuesto por seis dominios omnipresentes. hélices transmembrana, M1-M6 (Figura complementaria 1). Además, las P1B-ATPasas poseen dos hélices transmembrana N-terminales MA y MB, y de uno a seis dominios de unión a metales pesados ​​(HMBD) típicamente N-terminales, teniendo este último un papel enigmático para la función ligada a la captación de iones y/o regulación11,12,13. La superfamilia sigue el llamado ciclo de reacción Post Albers, un mecanismo de acceso alterno definido por conformaciones E1 orientadas hacia adentro y E2 orientada hacia afuera con alta y baja afinidad, respectivamente, por la carga transportada desde el citoplasma (in) al extracelular/luminal. lados (exteriores) (Fig. 1) 14,15. La absorción de carga y la oclusión del citosol se logra en las conformaciones E1, y junto con la fosforilación dependiente de ATP de un aspartato catalítico invariante en el dominio P que produce la forma E1P, esto conduce a la transición al estado E2P orientado hacia afuera. Luego, la carga se libera al espacio extracelular y, tras la desfosforilación (E2), la bomba vuelve a la conformación E1 orientada hacia adentro.

a La estructura muestra la configuración típica del dominio ATPasa de tipo P, con tres dominios citosólicos A (coloreados en amarillo), P (azul) y N (rojo) y un dominio M que atraviesa la membrana. Las hélices MA-MB específicas de P1B se muestran en cian y M1-6 en gris. Se destacan características y motivos funcionalmente importantes. b Ciclo de reacción post-Albers. Los recuadros demuestran las alineaciones estructurales del dominio P de las estructuras AfCopA determinada (estado E1) y las estructuras LpCopA (E2P y E2.Pi; PDB-ID 4BBJ y 4BYG) disponibles (en colores) con los estados correspondientes de SERCA (en gris; 4H1W , 3B9B y 3FGO), con los dominios M eliminados para mayor claridad. Los estados E2 demuestran una superposición considerable con SERCA, mientras que la determinada estructura E1 muestra una organización distinta.

Hasta ahora, la información estructural sobre el núcleo de P1B-ATPasa se limita a estructuras de CopA de Legionella pneumophila (LpCopA), ATP7B de Xenopus tropicalis y ZntA de Shigella sonnei en las conformaciones E2P y E2.Pi16,17,18,19, así como como dominios solubles individuales y un modelo crio-EM de baja resolución de CopA de Archaeoglobus fulgidus (AfCopA)20,21,22. En consecuencia, no se ha informado ninguna conformación unida a metal (E1) de una P1B-ATPasa, lo que deja difíciles de alcanzar los principios mecanicistas básicos con respecto a la captación, transferencia y unión de iones. Normalmente, las cuproproteínas suministran cobre a las P1B-ATPasas in vivo, es decir, Archaeoglobus fulgidus CopZ a AfCopA23 o su homólogo Atox1 a ATP7A/B humano. Sin embargo, aunque se ha propuesto que una plataforma electropositiva, MB', entre MB y M1 está involucrada en el reclutamiento de CopZ24, los determinantes moleculares de la transferencia de Cu+ mediada por chaperonas a la ATPasa son difíciles de alcanzar. Aquí, informamos tres estructuras E1 orientadas hacia adentro de una ATPasa tipo P que transporta cobre, lo que proporciona información fundamental sobre la captación y el transporte de iones por parte de toda la subclase P1B.

Para arrojar más luz sobre el mecanismo de entrada y transporte de iones de las P1B-ATPasas, nos dirigimos a CopA del organismo modelo Archaeoglobus fulgidus utilizando una construcción truncada que carece del dominio de unión a metales pesados ​​N- y C-terminal (AfCopAΔNΔC). La cristalización se realizó en presencia de altas concentraciones de lípidos y detergentes (el método HiLiDe25) y CuSO4 0,5 mM, lo que produjo cristales que difractaron con una resolución de 2,7 Å. La estructura se determinó utilizando el reemplazo molecular como método de fases. El modelo final arrojó un R/Rlibre de 22,5/25,7 (Tabla complementaria 1) y permitió el modelado de cadenas laterales en los dominios A, P y la mayor parte del dominio M, mientras que se observó una resolución local algo menor en el dominio N. , probablemente debido a la ausencia de nucleótidos y la falta de contactos cristalinos en esa región (Figuras complementarias 2-3 y métodos).

La estructura AfCopA recuperada exhibe la arquitectura P1B-ATPasa anticipada16,17,18,19,26, incluidos los dominios citosólicos A, P y N y un total de ocho hélices que atraviesan la membrana, MA, MB y M1-M6. separando claramente estas bombas moleculares de otros tipos de ATPasas tipo P (Fig. 1a y Fig. 1 complementaria). Sin embargo, en el dominio P la bolsa de unión de nucleótidos del dominio N se enfrenta al aspartato catalítico (D424), mientras que entre los dominios A y N existe una gran distancia, desviándose claramente de las conformaciones previamente determinadas de P1B-. ATPasas. Para integrar la estructura determinada de AfCopA en el ciclo general de reacción de la ATPasa tipo P, realizamos alineamientos basados ​​en la estructura de los dominios solubles con las estructuras disponibles de la bien estudiada ATPasa tipo P sarco/retículo endoplásmico (SERCA), transportadora de Ca2+. revelando las mayores similitudes con las conformaciones de [Ca]2 E1·ATP (PDB-ID 3N8G, 1T5S y 1T5T) (Figura complementaria 4)27. Esto fue inesperado, ya que los cristales de AfCopA se generaron en presencia de carga, pero sin ATP o análogos no hidrolizables del mismo, es decir, equivalentes a las condiciones que capturan los primeros estados E1 de SERCA. Además, los cristales de AfCopA obtenidos en ausencia de cobre y nucleótidos produjeron una estructura con una conformación general similar, lo que nuevamente indica una conformación E1 temprana y tal vez una preferencia E1 (estado fundamental) por este miembro de CopA en particular (Figuras complementarias 3-). 5 y Métodos).

Sin embargo, las posiciones de los motivos conservados de desfosforilación ((T/S)GE) y unión de nucleótidos (HP) de los dominios A y N, respectivamente, en relación con el dominio P en la estructura AfCopA determinada no revelan similitudes con cualquiera de las estructuras disponibles de SERCA (Fig. 1 y Figs. complementarias 4 y 6). Esto contrasta con las estructuras E2P y E2.Pi de P1B-ATPAsas informadas anteriormente, que se superponen bien con las conformaciones SERCA correspondientes (Fig. 1b y Fig. 4 complementaria). La disposición peculiar de los dominios solubles de AfCopA en el estado E1 determinado en relación con SERCA se vuelve particularmente clara al considerar la posición del bucle de desfosforilación invariante (T/S)GE del dominio A. En la estructura AfCopA, se coloca al final de M4, mientras que se ubica en el otro lado del dominio P en las estructuras E1 de SERCA (PDB-ID 4H1W y 3N8G)28,29 (Fig. 1b y Fig. complementaria .7).

Es de destacar que la configuración de los dominios solubles de AfCopA se parece bastante a los estados E1 y E1P recientemente determinados de la ATPasa KdpB de tipo P de clase 1A, que forma parte del complejo KdpFABC30,31 (Figura complementaria 7). Las similitudes observadas entre las ATPasas P1A y P1B pueden racionalizarse por el origen evolutivo compartido y la topología similar de las subfamilias, es decir, la ausencia de una extensión del dominio A N-terminal y hélices M8-10, que están presentes en otras clases. de ATPasas tipo P. Sin embargo, la integración de KdpB en el complejo KdpFABC lo convierte en un miembro atípico de la superfamilia de ATPasa tipo P, y las P1B-ATPasas probablemente operan de una manera profundamente diferente. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la estructura determinada de AfCopA se asemeja a una conformación E1 desviada, lo que probablemente afecta el modo de acción de la P1B-ATPasa.

Las comparaciones estructurales con la estructura E2.Pi de LpCopA16 determinada previamente revelan reordenamientos importantes durante la transición E2 → E1 (Fig. 2 y Fig. complementaria 8). Lo más notable es que una gran rotación del dominio A de aproximadamente 100° en relación con el dominio P mueve el motivo de desfosforilación conservado (T/S)GE del aspartato catalítico del dominio P, posicionándolo inmediatamente en las proximidades del final de M4, donde se estabiliza mediante interacciones electrostáticas con el dominio P (Figura complementaria 9). El dominio CopA A y el motivo (T/S)GE experimentan una rotación en sentido antihorario en relación con el dominio P visto desde el citosol. Junto con el desplazamiento del dominio A, el dominio N se inclina, cerrando así la cabecera citosólica, preparando la bolsa de unión de nucleótidos para la unión de ATP (Figura complementaria 10).

Regiones accesibles al disolvente del dominio M (trigo) de a, b la estructura AfCopA E1 aquí determinada yc, d el estado E2P de LpCopA (PDB-ID 4BBJ con los residuos numerados como AfCopA). En la estructura AfCopA E1, el motivo CPC conservado en M4 está expuesto al citosol, mientras que la conformación LpCopA E2 está abierta hacia afuera. La alineación del estado AfCopA E1 con el dominio P de LpCopA (PDB-ID 3RFU) ilustra cambios conformacionales durante la transición E2.Pi → E1, lo más sorprendente es una gran rotación del dominio A. f Matriz de diferencia de distancia del dominio M que detecta movimientos relativos entre hélices63. Para ello, se generó un modelo de homología de AfCopA basado en la estructura E2.Pi de LpCopA utilizando SwissModel52 y se asignaron MA-M6 manualmente. MA-M2 y M3-M6 apenas se reorganizan entre sí, formando por lo tanto dos haces separados de hélices, mientras que se producen cambios de hasta 6 Å entre los subdominios.

La rotación E2 → E1 en sentido antihorario del dominio A es similar a la situación en KdpB31 pero opuesta a SERCA, donde el motivo TGE gira en el sentido de las agujas del reloj (Figura complementaria 7). Pero, ¿cuál es la consecuencia mecanicista y el origen de esta diferencia fundamental entre las ATPasas P1 y P2? La ubicación distinta del dominio A en CopA y SERCA debe estar dictada por la arquitectura general. Como se indicó anteriormente, las P1B-ATPasas carecen de la extensión del dominio A N-terminal y, en consecuencia, del conector A/M1. En SERCA, este tramo de conexión determina el espacio intermedio entre M1 y la porción distal del dominio A, dejando la distancia esencialmente constante entre los estados E2.Pi y E1 (Figura complementaria 11). Esto es de particular importancia ya que se sabe que la longitud del conector A/M1 es crítica para el ciclo de reacción SERCA, ya que las inserciones o eliminaciones anulan la actividad ATPasa32. Por el contrario, debido a la ausencia de la extensión del dominio A N-terminal en las P1B-ATPasas, el dominio A está menos restringido conformacionalmente y la distancia mencionada disminuye de 69 a 65 Å durante la transición E2.Pi → E1 (Figura complementaria 11).

De manera análoga, las modificaciones del enlazador A/M3, que generalmente adopta una forma suelta alargada en los estados E1 mientras que es más estructurado en las conformaciones E2, afecta la función de SERCA33,34. Este cambio en el ciclo de transporte en SERCA probablemente esté respaldado por interacciones electrostáticas estabilizadoras entre los dominios A y P en las conformaciones E233. Sin embargo, las partes de los dominios P ​​y A que forman estas interacciones están ausentes en las P1B-ATPasas (Figura complementaria 9). La falta de estas características confiere un parche de superficie electronegativo general al dominio P de CopA, que permite la interacción con residuos electropositivos del dominio A también en la conformación E1 determinada (Figura complementaria 9). Como consecuencia, el enlazador A/M3 se acorta en 4,6 Å con la transición E2.Pi → E1, mientras que la distancia se amplía en 3,3 Å en SERCA (Figura complementaria 11).

En conjunto, esto demuestra que las fuerzas de empuje y tracción ejercidas sobre el dominio A durante el curso del mecanismo de transporte son significativamente diferentes entre las ATPasas P1 y P2 clásicas, de acuerdo con la disposición atípica detectada de las ATPasas. dominio de CopA. Es posible especular que la ausencia postulada de contraiones y diferencias estructurales, como la falta del conector A/M1 en P1B-ATPasas11, conduce a la necesidad de una estimulación alternativa de la transición E2.Pi → E1. Las restricciones más estrictas de los enlazadores A/M1 y A/M3 en el estado E1 pueden servir para tal propósito, impulsando la rotación del dominio A necesaria para alcanzar la conformación E1.

Inesperadamente, en el dominio M, MA-M2 y M3-M6 forman cada uno un haz de hélices, que se mueven entre sí en la transición E2.Pi → E1, como lo revelan análisis imparciales de las ubicaciones relativas de cada hélice transmembrana en los dos estados (Fig. 2 y Fig. complementaria 12). En la estructura E1 determinada, M2 y M6 convergen en la intersección de estos subdominios. Como consecuencia, la vía de salida de iones propuesta anteriormente se obstruye, haciéndola inaccesible desde el exterior, como se desprende del análisis realizado con el software HOLLOW17,35 (Fig. 2a-d). En cambio, en el lado opuesto, el interior proteico está expuesto al ambiente intracelular. Por lo tanto, la estructura determinada muestra una conformación E1 orientada hacia adentro.

A pesar de la ausencia de información estructural, la unión del cobre a las P1B-ATPasas se ha estudiado ampliamente36,37,38. Con base en la teoría ácido-base de Pearson (HSAB), se anticipa que el Cu+ con una carga relativamente pequeña y naturaleza “blanda” será coordinado más favorablemente por cisteínas, metioninas y, en menor medida, histidinas “más blandas” y polarizables, en contraste. a otros iones metálicos39. En consecuencia, se ha propuesto que la absorción de iones del citosol se produzca a través de un sitio de entrada formado por M158 conservado (en la transición MB' - M1), E205 (M2) y D336 (M3)16,17,24. Posteriormente se introdujo un modelo alternativo basado en azufre, en el que Cu+ se une a un sitio transitorio formado por M158 junto con C380 y C382 del motivo CPC ubicado en un pliegue característico de M438. Luego, el ion sería transportado desde el sitio de entrada o/a través del sitio transitorio a los ligandos de alta afinidad en el dominio M. Se espera una unión de iones de alta afinidad entre las hélices transmembrana M4-M6, que albergan varios aminoácidos invariantes, incluidos los residuos de CPC, así como Y682, N683, M711, S714 y S715 de los motivos YN (M5) y MxxSS (M6).

En la estructura AfCopA determinada, a diferencia de las conformaciones E2P y E2.Pi de LpCopA16,17, C380 y C382 están expuestas en la superficie, orientadas hacia M1-2, incluido M158 en el modelo final, lo que nuevamente indica una conformación E1 temprana congruente con la absorción de iones ( Figuras 2a y 3a). Sin embargo, si bien la disposición de M158, C380 y C382 está de acuerdo con la coordinación de Cu + junto con el sitio transitorio mencionado anteriormente, no pudimos asignar de manera inequívoca la presencia de metal en el conjunto de datos de alta resolución (Fig. 4d). Por el contrario, Y682, N683 y M711 están orientados hacia el centro de M4-6, preparados para la posterior unión de Cu+ de alta afinidad, por lo que incluyen un desplazamiento sustancial de M711 en relación con la conformación E2.Pi donde está expuesto a la membrana circundante (Fig. .3d). Para investigar la importancia funcional de estos residuos conservados en el transporte de cobre mediado por AfCopA, realizamos mediciones de la actividad ATPasa in vitro en proteínas reconstituidas en liposomas (Métodos). La rotación determinada estimulada por Cu+ de AfCopAΔNΔC de tipo salvaje fue de 242 ± 26 nmol Pi mg-1 min-1. Las sustituciones de alanina de los residuos M4-6 abolieron la función, mientras que se detectaron efectos menos dramáticos para los aminoácidos previamente propuestos como involucrados en la absorción de iones (Fig. 3a), lo que concuerda con observaciones anteriores sobre las proteínas CopA17,38,40. Además, medimos la unión de Cu + a AfCopAΔNΔC y seleccionamos sustituciones de alanina mediante plasma acoplado inductivamente - espectrometría de masas (ICP-MS), revelando una estequiometría promedio de 0,87 ± 0,10 iones Cu+ por proteína AfCopAΔNΔC (Fig. 3b). La unión de Cu + se vio particularmente afectada por la mutación de los residuos de cisteína C380 y C382 en el motivo CPC conservado en M4, pero también por los motivos YN (M5) y MxxSS (M6) (Fig. 3b). Por lo tanto, nuestros datos respaldan el requisito de numerosos residuos conservados en M4-6 para el transporte de Cu+ mediado por CopA, mientras que la orientación de estas cadenas laterales en la estructura determinada sugiere una conformación E1 temprana, como se logra mediante la reorientación de dos haces de hélices dentro del Dominio M.

una actividad ATPasa estimulada por Cu+ de formas mutantes seleccionadas determinada mediante un ensayo colorimétrico de ATPasa in vitro basado en proteína reconstituida en liposomas. AfCopAΔNΔC de tipo salvaje WT. Los datos se recopilaron sobre material de dos purificaciones independientes con n = 5 (M158A, E205A, D336A, C382A, S714A, S715A, D426N) o n = 6 (otros mutantes) y se presentan como media ± DE. b Estequiometrías de unión de Cu+ determinadas mediante mediciones de ICP-MS de formas mutantes seleccionadas. Los datos se recopilaron sobre material de dos purificaciones independientes con n = 5 (E205A) o n = 6 (otros mutantes) y se presentan como media ± DE. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c, d Vistas cercanas de la estructura AfCopA E1 observada desde el lado citoplasmático de los residuos relevantes en la región de entrada cy la supuesta región de unión de iones de alta afinidad d con la densidad electrónica final en σ = 1 mostrada en malla azul.

una representación de superficie electrostática de la estructura CopA determinada. El acoplamiento de CopZ se realizó con pyDockWEB45 utilizando un modelo de homología de la parte C-terminal de AfCopZ (ver Métodos para más detalles). b El refinamiento del conjunto alrededor del sitio de entrada de Cu+ produjo múltiples orientaciones posibles de la cadena lateral M158. La superficie electrostática se muestra para tres conjuntos seleccionados (I-III), lo que ilustra que las reorientaciones modestas tienen un impacto importante. c Modelo para la absorción de Cu+ basado en el acoplamiento CopZ y el refinamiento del conjunto. Es probable que los residuos de coordinación de Cu+ (el llamado motivo CxxC) de CopZ y M158 formen un sitio de absorción transitorio de Cu+, adoptando una conformación de cadena lateral orientada hacia arriba similar al conjunto II. La transferencia de Cu+ desde CopZ directamente a M158 es posible, probablemente sin la participación de E205 y D336, que anteriormente se propuso que participaran en la absorción de iones16,24. La reorientación de M158 conduce a la formación del sitio de entrada transitorio de Cu+ detectado en nuestros datos junto con C380 y C382 del motivo CPC en M4. d Datos anómalos recopilados en el borde de Cu compatibles con la presencia de un ion Cu+ unido a C382 en el sitio de entrada. Los mapas finales de 2Fo-Fc y de diferencias anómalas se muestran en malla azul y marrón, respectivamente.

Se debate el número y la ubicación de los sitios de unión de Cu+ de alta afinidad en las P1B-1-ATPasas, lo que representa un tema clave no resuelto en este campo. A pesar de la configuración abierta de nuestra estructura y con la intención de estudiar más a fondo los detalles del entorno físico-químico del sitio transitorio, recopilamos datos cristalográficos de rayos X en el borde de absorción de cobre (1,37 Å) que se difracta a 3,3 Å. La fase de MR-SAD en phenix.autosol41 utilizando la estructura final AfCopA E1 como modelo de búsqueda dio como resultado una subestructura con indicaciones de un único sitio Cu+ cerca de C382 del motivo CPC, sin signos de cobre entre M4-6, aunque no puede ser Se excluye que la señal se relacione con un átomo que no sea de cobre (Fig. 3 y Tabla complementaria 1). Un mayor refinamiento arrojó una ocupación del 60% del ion Cu+ en la posición detectada, con una estructura general mantenida y con una disposición similar de la región que rodea el sitio Cu+ en comparación con el conjunto de datos recopilados en una longitud de onda de 1 Å. Específicamente, ambas cisteínas del motivo CPC están enfrentadas a M158 espaciadas por 4,4 y 5,1 Å, congruente con una coordinación Cu+ trigonal-planar. De hecho, las simulaciones de dinámica molecular (MD) de la estructura determinada insertada en una membrana in silico respaldan la coordinación de Cu + de M158, C380 y C382, luego de la absorción del ambiente acuoso circundante (Figuras complementarias 13a, b). Sin embargo, las sustituciones de alanina de M158 y los vecinos N157 y D159 en el ensayo de liposomas explotados no alteran significativamente la actividad de la ATPasa estimulada por Cu+ in vitro, en contraste con un informe anterior con entornos experimentales alternativos (ver más abajo) (Figs. 2a y 3a). 42. Además, la sustitución de alanina de M158 no altera la estequiometría de unión de Cu+ a AfCopAΔNΔC como lo revela ICP-MS (Fig. 3b), lo que indica un papel en la captación de Cu+ en lugar de la unión de Cu+ de alta afinidad. En este contexto, vale la pena mencionar que el mapa de densidad electrónica obtenido parece mal resuelto alrededor del motivo CPC, incluida la cadena lateral del M158. Por lo tanto, estábamos interesados ​​en evaluar más a fondo la dinámica alrededor del sitio de entrada de Cu+ y aplicamos el enfoque de refinamiento del conjunto implementado en Phenix43,44 (Fig. 4b y Fig. 14 complementaria). Los modelos obtenidos concuerdan bien con la calidad general de los datos, es decir, con sólo variaciones sutiles dentro del dominio A, P y la mayor parte del dominio M, y con heterogeneidad alrededor de los extremos, los bucles periplásmicos y el dominio N. Sin embargo, como se esperaba del análisis de datos original, el motivo CPC en la parte desenrollada de M4 y la cadena lateral de M158 presentan flexibilidad conformacional (Fig. 4b). Teniendo en cuenta que los mapas de densidad electrónica son de alta calidad para todas las demás partes del dominio M, es tentador especular que la dinámica detectada refleja la flexibilidad biológica en la región de entrada del cobre en la conformación E1 determinada. En esta línea, las simulaciones MD que exploran la entrada de Cu+ dieron como resultado interacciones con M158, C380, C382, pero no con los residuos conservados restantes, lo que indica que la conformación de la proteína puede coordinar el ion, pero aún no está abierta a la alta afinidad interna. sitio de unión (Figura complementaria 13). Como tal, el sitio identificado se asemeja a un sitio de entrada de Cu+ transitorio y flexible para la absorción de cobre, de acuerdo con la conformación temprana aislada de E1. De hecho, dos simulaciones MD complementarias de 100 ns con un Cu + inicialmente colocado en la posición de azufre trigonal de AfCopA, indican una transferencia rápida hacia M711 junto con dos o tres moléculas de agua coordinadas (Figura 13 complementaria).

¿Cómo se logra la absorción de Cu+ del medio en las P1B-ATPasas? Notablemente, la estructura AfCopA determinada presenta una baja electronegatividad en la región de absorción de Cu+ que rodea a M158, C380 y C382. La investigación de conjuntos individuales revela que solo reordenamientos menores alrededor del sitio de entrada de Cu+ afectan fuertemente la superficie electrostática (Fig. 4a). En particular, M158 tiene un fuerte efecto sobre la carga expuesta al entorno. Sin embargo, con respecto a la teoría HSAB, un entorno local tan cargado negativamente puede no ser necesario para el acceso y entrega del cobre. En cambio, la presencia de un entorno de coordinación rico en ligandos de aminoácidos "blandos" que contienen azufre (como metioninas y/o cisteínas), como se observa aquí, puede impulsar el evento de transferencia de Cu+.

En este contexto, también es importante que, a diferencia de otros iones, el Cu+ citosólico esté siempre unido a chaperonas y, según el modelo actual, se espera que se transfiera directamente desde estas pequeñas proteínas solubles, como CopZ, a CopA24.

Para investigar más a fondo esta entrega, realizamos el acoplamiento computacional de un modelo de homología de la parte C-terminal de CopZ de A. fulgidus a la conformación E1 determinada usando pyDockWEB45, lo que sugiere que CopZ encaja bien en el surco entre MB' y M2-4 ( Figura complementaria 15). En este modelo de interacción, la CopZ generalmente electronegativa se enfrenta a la plataforma MB' electropositiva, lo que respalda la idea de que la complementación electrostática guía la unión de CopZ a CopA24. Algunas de las conformaciones de M158 detectadas por nuestro enfoque de refinamiento de conjunto se ubican dentro de 6 Å del ion Cu + unido a CopZ (Fig. 4c), lo que ilustra que la transferencia directa de Cu + de CopZ a M158 bien puede ser posible. Una transferencia tan directa de Cu+ requeriría la presencia de otro sitio de transición más, en el que M158 está involucrado frente al citosol, junto con las cisteínas CxxC de CopZ (Fig. 4). Luego, Cu+ pasaría al sitio de entrada formado por M158, C380 y C382, y al sitio o sitios de unión membranosos de alta afinidad. Especulamos que la superficie expuesta E205 y D336 están involucradas en la absorción de Cu+ al crear un ambiente adecuado para estimular la liberación de CopZ, o mediante la estabilización del complejo CopA - CopZ, unificando los mecanismos disponibles de absorción de cobre.

Estudios bioquímicos previos que compararon la actividad ATPasa in vitro de CopA de tipo salvaje estimulada por Cu+ libre (usando cisteína como vehículo) o CopZ cargado con Cu+ revelaron que solo la actividad ATPasa estimulada por Cu+-CopZ fue abolida a través de sustituciones de alanina en el área de entrada, mientras que la actividad de la ATPasa libre estimulada por Cu+ se mantuvo sin cambios24. Esto no solo concuerda con nuestros datos sobre AfCopAΔNΔC (Fig. 3a), sino que también enfatiza el papel específico de M158, E205 y D336 en la absorción de iones. Dado que las chaperonas entregan Cu+ al núcleo de la ATPasa, estos residuos en el área de entrada parecen ser importantes in vivo, probablemente porque generan una región de acoplamiento y transferencia apropiada para la liberación de Cu+ de las chaperonas combinada con la incapacidad estérica de las chaperonas para alcanzar directamente el núcleo de la ATPasa. los ligandos membranosos de unión a Cu+ de alta afinidad. El Cu+ unido a cisteína bien puede evadir este requisito, reemplazando a M158 como donante de cisteínas CPC. Por lo tanto, nuestra estructura E1 también proporciona una hipótesis plausible de donación de Cu+ a las proteínas CopA, combinando los modelos anteriores, algo conflictivos, de absorción de iones.

Con base en análisis detallados del estado E1 determinado estructuralmente y comparaciones con estructuras ya disponibles combinadas con caracterización funcional, proponemos que las P1B-ATPasas específicas de cobre operen utilizando el siguiente mecanismo de transporte (Fig. 5). La transición E2.Pi → E1 ocurre junto con cambios conformacionales importantes, en particular una gran rotación del dominio A, probablemente provocada por la liberación de fosfato tras la desfosforilación de acuerdo con el mecanismo de acceso alterno de la ATPasa tipo P conservada. En conjunto, MA-M2 se desplaza en relación con M3-6, exponiendo el motivo CPC específico de ATPasa de tipo P1B de M4 al citoplasma (Figs. 2a y 4).

En el estado E2P, el motivo CPC conservado en M4 está expuesto al espacio extracelular. La transición a la conformación E1 abierta hacia adentro se produce mediante movimientos de MA-M2 en relación con M3-M6. Guiada por interacciones electrostáticas, la chaperona citosólica CopZ se acopla a la plataforma MB. Luego, Cu+ se transfiere al sitio de entrada de iones transitorios en el dominio M, formado por una metionina (M158) en el extremo citosólico de M1 y las dos cisteínas (C380 y C382) del motivo CPC en M4. A continuación, el metal se transfiere a los sitios de unión de iones de alta afinidad, probablemente formados por el motivo CPC y una metionina (M711) en M6, antes de la liberación al espacio extracelular.

La estructura E1 representa un estado de absorción de Cu+ capaz de unirse a CopZ con destino a la carga, como lo confirma el acoplamiento computacional. Alternativamente, el HMBD N-terminal, que es estructuralmente homólogo a CopZ, o ligandos moleculares pequeños como el glutatión, pueden proporcionar Cu+ al núcleo de la ATPasa. La posición única del dominio A, que es diferente a las ATPasas P2 y P3, es necesaria para crear espacio suficiente para que CopZ se acople al núcleo de la ATPasa, ya que su posición en SERCA obstaculizaría estéricamente la interacción. La orientación de la cadena lateral M158 hacia el citosol, determinada utilizando el enfoque de refinamiento de conjunto, permite la coordinación Cu+ trigonal-planar junto con las cisteínas del motivo CxxC conservado de CopZ, es decir, un sitio transitorio formado por residuos mixtos de CopA-CopZ sin contacto directo. influencia de E205 y D336 (Fig. 4), de acuerdo con la vía de transporte a base de azufre propuesta previamente para LpCopA38. Sin embargo, no se puede excluir que E205 y D336 también participen directamente en la transferencia de iones. En el estado E1 determinado, las conformaciones de cadena lateral de M158, C380 y C382 permiten la coordinación de Cu+ trigonal-planar (Figs. 3b y 4). Esto está respaldado por una señal anómala en este sitio, como se detecta en el conjunto de datos recopilados en el borde de Cu+. Presumiblemente, el metal se transporta al sitio identificado a través de M158 y luego pasa a los sitios de unión de iones de alta afinidad en estados E1 posteriores, probablemente a través de C380 y C382. Observamos que M711 ha adoptado una configuración diferente en la estructura E1, apuntando hacia el centro de M4-6, compatible con la formación de un único sitio de alta afinidad (Fig. 2a-d). La liberación al espacio extracelular puede tener lugar posteriormente a través de la vía de liberación detectada entre MA, M2 y M617, nuevamente de acuerdo con los subdominios MA-M2 y M3-6 revelados en este trabajo. Anteriormente se había propuesto lograr la regulación del transporte del PIB a través de los HMBD, que se ha demostrado que interfieren con la rotación en condiciones de deficiencia de cobre13. Curiosamente, la ubicación de los dos últimos HMBD en la estructura X. tropicalis ATP7B E2.Pi es estructuralmente incompatible con la inhibición en nuestra estructura E1 debido a la disposición del dominio A19 (Figura complementaria 16). Por lo tanto, es posible que la inhibición ocurra en los estados E2, con un HMBD unido entre los dominios A y P, y que la liberación del HMBD luego active el transporte.

En conclusión, aquí presentamos la estructura de la proteína modelo AfCopA, una P1B-ATPasa transportadora de cobre de A. fulgidus, en una conformación E1 orientada hacia adentro. En este estado, la disposición del dominio A difiere en comparación con otras subfamilias de ATPasa tipo P, lo que sugiere que el mecanismo general de transporte de ATPasa tipo P está menos conservado de lo que se suponía anteriormente. Nuestros datos revelan el mecanismo de captación de Cu+ de las chaperonas citosólicas y su entrega al núcleo de ATPasa, en el que M158 desempeña un papel fundamental. Estos representan hallazgos clave que probablemente también sean transferibles a los miembros humanos, ATP7A y ATP7B. Sin embargo, se requieren estructuras adicionales unidas a metal de estados E1 posteriores para descifrar la arquitectura de los sitios de unión de iones de alta afinidad en las P1B-ATPasas.

Se clonó AfCopAΔNΔC (residuos G80-G736) (UniProtKB - O29777) en pET-22b(+) y se expresó en Escherichia coli (cepa C43). Las células se cultivaron en medio LB suplementado con 0,1 mg/ml de ampicilina a 100 rpm, 37 °C en matraces con deflectores hasta que la densidad óptica (OD600) alcanzó 0,8 – 1. A continuación, se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil β 1 mM. -D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y la temperatura se redujo a 20 °C. Después de 16 h, las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 x g durante 15 min. Las células se resuspendieron en tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH = 7,6, KCl 200 mM, glicerol al 20% (v/v)) a 5 ml por g de células y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. La suspensión celular se complementó con β-mercaptoetanol (BME) 5 mM, DNasa I 4 µg/ml, MgCl2 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM e inhibidores de proteasa Sigma (1 tableta por 6 l de cultivo celular) antes de la alteración celular. a 25 kpsi en un homogeneizador de alta presión (Constant System). Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación de 30 minutos a 20.000 × g, seguido de la recolección de membranas mediante centrifugación de 3 h a 185.500 × g. Las membranas se resuspendieron en tampón B (Tris-HCl 20 mM, pH = 7,6, KCl 200 mM, glicerol al 20 % (v/v), MgCl2 1 mM, BME 5 mM) a 10 ml por g de membranas. Las membranas se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Las membranas se solubilizaron en n-dodecil β-D-maltopiranósido (DDM) al 1% (p/v) a 4 °C durante 2 h a una concentración de proteína de 3 mg/ml, según lo determinado por el ensayo de Bradford. Las membranas insolubilizadas se sedimentaron mediante ultracentrifugación de 1 h a 185.500 × g. Se agregaron imidazol 30 mM y KCl 500 mM al sobrenadante y luego se cargó la muestra en una columna HiTrap Chelating HP de 5 ml (Cytiva). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón C (Tris-HCl 20 mM, pH = 7,6, KCl 200 mM, glicerol al 20 % (v/v), MgCl2 1 mM, BME 5 mM, octaetileno 0,15 mg/ml. glicol monododecil éter (C12E8, de Nikkol)) que contenía imidazol 50 mM, y posteriormente se eluyó en tampón C con concentración creciente de imidazol, terminando con 5 CV de imidazol 500 mM. Se combinaron las fracciones que contenían AfCopAΔNΔC y se añadió proteasa TEV en una proporción de 1:10 (p/p). La muestra se dializó frente a Tris-HCl 20 mM, pH = 7,6, KCl 80 mM, glicerol al 20 % (v/v), MgCl2 1 mM, BME 5 mM, C12E8 0,15 mg/ml a 4 °C durante 16 h para eliminar el imidazol. . Al día siguiente, la muestra se complementó con imidazol 30 mM y se añadió KCl sólido hasta una concentración final de 500 mM. La muestra se cargó nuevamente en una columna HiTrap Chelating HP de 5 ml (Cytiva), se recogió el flujo que contenía AfCopAΔNΔC escindido, se evaluó mediante SDS-PAGE y se concentró a aproximadamente 20 mg/ml en un concentrador Vivaspin (MWCO = 50 kDa). ). En esta etapa, se obtuvieron de forma rutinaria de 8 a 10 mg de AfCopAΔNΔC purificado de 1 litro de cultivo celular. Se centrifugaron 50 mg de proteína a 20.000 x g durante 10 minutos antes de la inyección en una columna de grado de preparación Superose™ 6 (Cytiva) autoempaquetada de 120 ml. La proteína se eluyó en tampón D (Tris-HCl 20 mM, pH = 7,6, KCl 80 mM, glicerol al 20 % (v/v), MgCl2 3 mM, BME 5 mM, C12E8 0,15 mg/ml) y las fracciones que contenían AfCopAΔNΔC se eluyeron. Se reunieron y se concentraron a 10 mg/ml en un concentrador Vivaspin (MWCO = 50 kDa). La proteína se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó en alícuotas a -80 °C hasta su uso posterior. Los resultados de la purificación se muestran en la figura complementaria 17.

Los ensayos de cristalización macromolecular se realizaron utilizando el enfoque HiLiDe (altas concentraciones de lípidos y detergentes)25. Se preparó una solución madre de 25 mg/ml de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (Anatrace) en cloroformo y se generó una fina película lipídica en un vial de vidrio mediante evaporación de cloroformo bajo una corriente de nitrógeno. . Se agregaron 10 mg/ml de muestra de proteína AfCopA y C12E8 para obtener concentraciones finales de 2,25 mg/ml de DOPC y 5 mg/ml de C12E8. La muestra se incubó durante 16 h a 4 °C con agitación suave. Los agregados se eliminaron mediante ultracentrifugación a 50.000 × g durante 20 minutos, después de lo cual se añadió CuSO4 1 mM al sobrenadante (no se realizó suplementación para los cristales de apo). Los cristales se cultivaron utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante, en placas de 24 pocillos que contenían 400 µl de solución de depósito suplementada con BME 5 mM, en gotas hechas de 1 µl de muestra de proteína y 1 µl de solución de depósito. Se obtuvieron cristales que difractaban a 3,3 – 3,5 Å después de 10 días en citrato de amonio 1,5 M, MES 0,1 M, pH = 5,5. Los datos finales que difractaron a 2,8 Å se recogieron en un cristal para el que se utilizó como aditivo Lyso PC 06:0 5,0 mM (Avanti). Todos los cristales se pescaron utilizando LithoLoops (Molecular Dimensions) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los datos se recopilaron en Swiss Light Source, el Instituto Paul Scherrer, Villigen, Suiza, línea de haz X06SA.

Los datos recopilados se procesaron y escalaron utilizando XDS46. La determinación y el refinamiento de la estructura posterior se lograron utilizando Phenix44. Las fases iniciales se obtuvieron en PHASER47 mediante reemplazo molecular, aplicando las estructuras de los dominios A y PN solubles de AfCopA (PDB-IDs 2B8E y 3A1C)20,21 junto con el dominio M de LpCopA (PDB-ID 3RFU)16. como modelos de búsqueda. La construcción inicial del modelo se logró en Coot48, y el refinamiento de Rosetta49 se empleó en las primeras etapas de la construcción del modelo. Los datos permitieron el modelado de cadenas laterales en los dominios A, P y M, y las conformaciones de las cadenas laterales en el dominio N se guiaron utilizando estructuras cristalinas disponibles (PDB-ID 3A1C)21. El modelo final incluye los residuos 82-736, solo faltan 4 residuos en el extremo N de la forma truncada aquí explotada. Todas las figuras estructurales se generaron usando PyMOL50, usando el complemento electrostático PyMol APBS51 para representaciones de superficies electrostáticas. Para establecer el modelo de acoplamiento AfCopA-AfCopZ, se generó un modelo de homología de la parte C-terminal de AfCopZ que alberga CxxC en SwissModel52 utilizando la estructura CopZ de E. hirae (PDB-ID 1CPZ)53 como plantilla. El acoplamiento a la estructura AfCopA E1 determinada (conjunto de datos de alta resolución) se realizó utilizando pyDockWEB con entradas N157-D159 (AfCopA), C149 + C152 (AfCopZ).

Los plásmidos mutantes se generaron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning (Agilent Technologies). Los mutantes puntuales se expresaron como el tipo salvaje en duplicados de 2 l de medio LB por mutante, basándose en colonias de transformación separadas. La preparación y purificación de la membrana se realizó como se describió anteriormente para el AfCopAΔNΔC de tipo salvaje, pero con las siguientes diferencias: las membranas de un cultivo celular de 2 litros se solubilizaron durante 2 h en 60 ml de tampón B suplementado con DDM al 1%. El material solubilizado se incubó durante 1 hora a 4 °C con 1 ml de resina Ni Sepharose™ suelta (Cytiva) equilibrada en tampón C, tras lo cual se realizó una purificación por afinidad utilizando columnas de gravedad. La muestra se cargó dos veces y luego la resina se lavó primero con 5 ml de tampón C, seguido de 10 ml de tampón C con imidazol 50 mM. La proteína se eluyó en 5 ml de tampón C con imidazol 500 mM y se añadió 1 mg de proteasa TEV por muestra. Al día siguiente, la muestra se incubó con 1 ml de resina de Ni fresca equilibrada en tampón C durante 1 hora a 4 °C y luego se cargó dos veces en columnas de gravedad. El flujo continuo que contenía mutantes AfCopAΔNΔC purificados se recogió y se concentró a 20 mg/ml. Todo el material (3-10 mg de proteína dependiendo de la mutación) se inyectó en una columna Superose 6 Increment 10/300 GL (Cytiva) y se eluyó en tampón D. Los mutantes se concentraron a >5 mg/ml y se congelaron instantáneamente en líquido. nitrógeno y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.

Para la preparación de liposomas, se generó una película delgada de 20 mg de DOPC mediante la evaporación con cloroformo de una solución madre bajo una corriente de nitrógeno y se colocó en un desecador de vacío durante 16 h. Todos los tampones se trataron con Chelax® 100 Chelating Resin (Bio-Rad) antes de su uso. La película lipídica se rehidrató en MOPS-KOH 20 mM, pH = 6,8, NaCl 100 mM, ácido ascórbico recién preparado 1 mM, cisteína recién preparada 10 mM y se colocó durante 3 × 15 minutos en un sonicador de baño. La muestra se expuso a 3 ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y posteriormente se extruyó 11 veces a través de filtros de 100 nm (Avanti). Los liposomas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Los liposomas se descongelaron y desestabilizaron mediante la adición de DDM al 0,01% (p/v) durante 1 h a 18 °C. La reconstitución se realizó con una relación molar de lípido:proteína de 20:1 con una concentración final de proteína de 0,5 mg/ml. La muestra de proteína concentrada y los liposomas se mezclaron con tampón de reconstitución (MOPS-KOH 20 mM, pH = 6,8, NaCl 100 mM, ácido ascórbico 1 mM) suplementado con 0,15 mg/ml de C12E8 y se incubaron durante 1 h a 4 °C. El detergente se eliminó mediante la adición de resina Bio-Beads™ SM-2 después de 1 h, 2 hy 18 h. Los proteoliposomas se recogieron mediante centrifugación a 60.000 x g durante 1,5 h y se resuspendieron en tampón de reconstitución. Luego, las muestras se utilizaron para medir la actividad ATPasa in vitro mediante un ensayo desarrollado originalmente por Baginski y colegas54. Brevemente, se agregaron 0,2 mg/ml de proteoliposomas a MOPS-KOH 20 mM, pH = 6,8, NaCl 100 mM, ácido ascórbico 1 mM, cisteína 10 mM y CuCl2 100 µM. El ensayo se realizó a 65 °C y las muestras se incubaron 10 minutos antes de que comenzara la reacción agregando ATP 5 mM (Sigma Aldrich). Se transfirieron 50 µl de las respectivas mezclas de reacción a una microplaca de 96 pocillos y se mezclaron con un volumen igual de solución de ácido ascórbico (formada mezclando una solución que contenía ácido ascórbico 0,17 M y SDS al 0,1 % en HCl 0,5 M con heptamolibdato de amonio acuoso 28,3 mM). en proporción 5:1, todos de Sigma Aldrich) después de 5, 12 y 18 min. El desarrollo del color se detuvo mediante la adición de 75 µL de solución de arsénico sódico (que consta de citrato trisódico 0,068 M, metaarsénico sódico 0,154 M y ácido acético glacial al 2 % v/v, todos de Sigma Aldrich) después de 10 minutos de incubación a 18 °C. Después de 30 minutos de incubación, se midió la absorbancia a 860 nm. Los datos presentados provienen de al menos 5 mediciones independientes en muestras de duplicados biológicos. Como también señalaron otros12,55, las muestras de CopA exhiben una alta actividad de fondo en ausencia de cobre agregado, lo que suponemos surge de niveles traza de cobre residual en nuestras muestras. La actividad de fondo del 30% se restó de los valores trazados (Figura complementaria 17). Las figuras que representan las mediciones de la actividad de la ATPasa se generaron utilizando GraphPad Prism.

La estequiometría de unión de Cu+ en AfCopA de tipo salvaje y mutantes se determinó mediante análisis ICP-MS. Las reservas de proteínas purificadas se diluyeron hasta 1 mg/ml final utilizando un tampón que contenía Tris 20 mM, pH = 7,6, KCl 80 mM, glicerol al 20 % (v/v), MgCl2 3 mM, BME 5 mM, C12E8 0,15 mg/ml. Se agregaron 4 equivalentes de Cu2+ (de una solución madre de CuCl2 en H2O) a las soluciones de proteínas y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. El exceso de cobre no unido se eliminó inyectando las soluciones de proteínas a través de una columna de desalinización HiTrap de 5 ml, preequilibrada con tampón. La concentración de proteínas eluidas se determinó mediante un ensayo de Bradford con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. Las muestras de proteínas eluidas se digirieron en HNO3 al 8% (p/v) (Sigma-Aldrich) a 80 °C durante 12 h. Posteriormente, las muestras se diluyeron para ajustar la concentración de HNO3 al 3 % final (p/v) y el contenido de cobre en las muestras se analizó con un espectrómetro de masas ICP Agilent 7900 conectado a un muestreador automático CETACASX-500 para la inyección de muestras. Se realizaron experimentos de control para la corrección de fondo utilizando tampón de proteínas excluyendo proteínas. Las figuras que representan las mediciones de ICP-MS se generaron utilizando GraphPad Prism.

Se insertaron dos conjuntos que diferían en la región CPC (indicados como I y II en la Fig. 4b) en parches de membrana DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) utilizando el constructor de membranas CHARMM-GUI56. El residuo de aminoácido E457 fue protonado como lo predijo PROPKA3.157,58. Los sistemas se solvataron en agua TIP3P y NaCl 150 mM y la energía se minimizó con un algoritmo de descenso más pronunciado de 5000 pasos. Los sistemas se equilibraron con la liberación gradual de las restricciones de posición del agua y los lípidos durante un total de 30 ns, seguido de ejecuciones de producción sin restricciones de 250 ns. Cada conformación de proteína también se simuló en simulaciones repetidas independientes a partir de un conjunto diferente de velocidades iniciales, sumando un total de muestreo de 250 ns × 4. Se aplicó un acoplamiento de temperatura Nose-Hoover59 utilizando una temperatura de referencia de 303,15 K. Un semi- Se aplicó un acoplamiento de presión isotrópico Parrinello-Rahman60 con una presión de referencia de 1 bar y una compresibilidad de 4,5e-5 bar-1. Los sistemas se simularon utilizando el paquete de simulación GROMACS-202161 y campos de fuerza totalmente atómicos CHARMM3662. El dominio de membrana se utilizó como referencia de alineación para la desviación cuadrática media, que mostró una evolución estable para la columna vertebral de la proteína entre 150-250 ns de cada trayectoria. Extrajimos una estructura promedio representativa del corte de 150 a 250 ns de las cuatro trayectorias e introdujimos un ion Cu+ en una posición citoplasmática 5 Å por encima de la vía indicada por el análisis de acoplamiento CopZ. En una breve simulación de 20 ps, ​​el ion Cu+ fue arrastrado en la dirección z a lo largo de la membrana vertical a 1 Å/ps con una constante de fuerza de 1000 kJ mol-1 nm-2. Para explorar las interacciones con posibles residuos de coordinación, también simulamos la estructura AfCopA con el ion Cu + inicialmente colocado en la posición indicada a partir de las observaciones experimentales (como en la Fig. 4d). Aquí, se minimizó y equilibró la energía de dos sistemas independientes durante 2 ns con liberación gradual de las restricciones de posición en las proteínas, lípidos e iones seguido de simulaciones de producción de 100 ns.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Las coordenadas estructurales generadas en este estudio se han depositado en el Protein Data Bank bajo los códigos de acceso: 7R0I (E1 en presencia de cobre), 7R0H (E1 en presencia de cobre con datos recopilados en el borde de cobre), 7R0G (E1 en la ausencia de cobre). Los datos originales se proporcionan con este documento. Todos los datos y materiales que respaldan los hallazgos del manuscrito están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Festa, RA y Thiele, DJ Cobre: ​​un metal esencial en biología. actual. Biol. 21, R877–R883 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robinson, Nueva Jersey y Winge, DR Metalochaperones de cobre. Año. Rev. Bioquímica. 79, 537–562 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palmgren, MG y Nissen, P. ATPasas tipo P. Año. Rev. P. Biofísica. 40, 243–266 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lyons, JA, Timcenko, M., Dieudonné, T., Lenoir, G. & Nissen, P. P4-ATPasas: cómo un perro viejo aprendió nuevos trucos: estructura y mecanismo de las flippasas lipídicas. actual. Opinión. Estructura. Biol. 63, 65–73 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

van Veen, S. y col. La deficiencia de ATP13A2 altera la exportación de poliaminas lisosomales. Naturaleza 578, 419–424 (2020).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

McKenna, MJ y cols. La P5A-ATPasa del retículo endoplásmico es una dislocasa de hélice transmembrana. Ciencia 369, eabc5809 (2020).

Purohit, R. y col. Transportador CopB específico de Cu+: revisión de la clasificación de la ATPasa tipo P1B. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 115, 2108–2113 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, AT, Smith, KP & Rosenzweig, AC Diversidad de las ATPasas de tipo P1B transportadoras de metales. J. Biol. Inorg. Química. 19, 947–960 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tanzi, RE et al. El gen de la enfermedad de Wilson es una ATPasa transportadora de cobre con homología con el gen de la enfermedad de Menkes. Nat. Genet 5, 344–350 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tønnesen, T., Kleijer, WJ y Horn, N. Incidencia de la enfermedad de Menkes. Tararear. Gineta. 86, 408–410 (1991).

Artículo PubMed Google Scholar

Sitsel, O. y col. Estructura y función de Cu(I)- y Zn(II)-ATPasas. Bioquímica 54, 5673–5683 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rice, WJ, Kovalishin, A. & Stokes, DL Papel de los dominios de unión de metales de la bomba de cobre de Archaeoglobus fulgidus. Res bioquímica biofísica. Comunitario. 348, 124-131 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Mandal, AK & Argüello, JM Funciones funcionales de los dominios de unión a metales de Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPasa CopA†. Bioquímica 42, 11040–11047 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Post, RL, Hegyvary, C. & Kume, S. Activación por trifosfato de adenosina en la cinética de fosforilación de la adenosina trifosfatasa de transporte de iones de sodio y potasio. J. Biol. Química. 247, 6530–6540 (1972).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Albers, RW Aspectos bioquímicos del transporte activo. Año. Rev. Bioquímica. 36, 727–756 (1967).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gourdon, P. y col. Estructura cristalina de una ATPasa tipo PIB transportadora de cobre. Naturaleza 475, 59–64 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Andersson, M. y col. Las ATPasas tipo P transportadoras de cobre utilizan una vía única de liberación de iones. Nat. Estructura. Mol. Biol. 21, 43–48 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, K. y col. Estructura y mecanismo de las ATPasas tipo P transportadoras de Zn2+. Naturaleza 514, 518–522 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amargo, RM et al. Estructura del transportador de cobre ATP7B de la enfermedad de Wilson. Ciencia. Adv. 8, eabl5508 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsuda, T. & Toyoshima, C. Reconocimiento de nucleótidos por CopA, una ATPasa tipo P transportadora de Cu+. EMBO J. 28, 1782-1791 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sazinsky, MH, Mandal, AK, Argüello, JM & Rosenzweig, AC Estructura del dominio de unión de ATP de la Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPasa. J. Biol. Química. 281, 11161–11166 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Allen, GS, Wu, C.-C., Cardozo, T. & Stokes, DL La arquitectura de CopA de Archeaoglobus fulgidus estudiada mediante microscopía crioelectrónica y acoplamiento computacional. Estructura 19, 1219-1232 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palumaa, P. Acompañantes de cobre. El concepto de control conformacional en el metabolismo del cobre. FEBS Lett. 587, 1902-1910 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Padilla-Benavides, T., McCann, CJ & Argüello, JM El mecanismo de las ATPasas de transporte de Cu+: interacción con las chaperonas de Cu+ y el papel de los sitios transitorios de unión de metales. J. Biol. Química. 288, 69–78 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gourdon, P. y col. HiLiDe: enfoque sistemático para la cristalización de proteínas de membrana en lípidos y detergentes. Cristal. Crecimiento Des. 11, 2098-2106 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Grønberg, C. et al. Estructura y mecanismo de liberación de iones de las ATPasas tipo PIB-4. eLife 10, e73124 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sorensen, TL-M. Transferencia de fosforilo y oclusión de iones de calcio en la bomba de calcio. Ciencia 304, 1672-1675 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Winther, A.-ML et al. La bomba de calcio unida a sarcolipina estabiliza los sitios de calcio expuestos al citoplasma. Naturaleza 495, 265–269 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Bublitz, M. y col. Vías iónicas en el retículo sarcoplásmico Ca2+-ATPasa. J. Biol. Química. 288, 10759–10765 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stock, C. y col. Las estructuras crio-EM de KdpFABC sugieren un mecanismo de transporte de K+ a través de dos medios canales entre subunidades. Nat. Comunitario. 9, 4971 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dulce, ME et al. Base estructural para el transporte de potasio en procariotas por KdpFABC. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. EE.UU. 118, e2105195118 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daiho, T., Yamasaki, K., Danko, S. y Suzuki, H. Papel fundamental del dominio del actuador de enlace de bucle Glu40-Ser48 y la primera hélice transmembrana de Ca2+-ATPasa en la desoclusión y liberación de Ca2+ de la fosfoenzima insensible al ADP. J. Biol. Química. 282, 34429–34447 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Toyoshima, C., Nomura, H. y Tsuda, T. Mecanismo de activación lumenal revelado en estructuras cristalinas de bombas de calcio con análogos de fosfato. Naturaleza 432, 361–368 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Holdensen, AN & Andersen, JP La longitud del conector A-M3 es un determinante crucial de la velocidad del ciclo de transporte de Ca2+ de la Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico. J. Biol. Química. 284, 12258–12265 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ho, BK y Gruswitz, F. HOLLOW: Generación de representaciones precisas de canales y superficies interiores en estructuras moleculares. Estructura BMC. Biol. 8, 49 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Mandal, AK, Yang, Y., Kertesz, TM y Argüello, JM Identificación del sitio de unión de metales transmembrana en ATPasas de tipo PIB transportadoras de Cu+. J. Biol. Química. 279, 54802–54807 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

González-Guerrero, M., Eren, E., Rawat, S., Stemmler, TL & Argüello, JM Estructura de los dos sitios de transporte transmembrana de Cu+ de las Cu+ -ATPasas. J. Biol. Química. 283, 29753–29759 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Mattle, D. y col. Una vía de transporte basada en azufre en asas Cu + - ATP. Representante EMBO 16, 728–740 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubino, JT y Franz, KJ Química de coordinación de proteínas de cobre: ​​cómo la naturaleza maneja una carga tóxica para una función esencial. J. Inorg. Bioquímica. 107, 129-143 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Argüello, JM, Mandal, AK y Mana-Capelli, S. CPx-ATPasas de transporte de metales pesados ​​del termófilo Archaeoglobus fulgidus. Ana. Académico de Nueva York. Ciencia. Rev. 986, 212–218 (2003).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Grosse-Kunstleve, RW & Adams, PD Procedimientos de búsqueda de subestructuras para estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 59, 1966-1973 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Padilla-Benavides, T., McCann, CJ & Argüello, JM El mecanismo de las ATPasas de transporte de Cu+: interacción con las chaperonas de Cu+ y el papel de los sitios transitorios de unión de metales. J. Biol. Química. 288, 69–78 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Burnley, BT, Afonine, PV, Adams, PD y Gros, P. Modelado de dinámica en estructuras cristalinas de proteínas mediante refinamiento de conjuntos. Elife 1, e00311 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Liebschner, D. y col. Determinación de la estructura macromolecular mediante rayos X, neutrones y electrones: desarrollos recientes en Phenix. Acta Crystallogr D. Estructura. Biol. 75, 861–877 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiménez-García, B., Pons, C. & Fernández-Recio, J. pyDockWEB: un servidor web para el acoplamiento proteína-proteína de cuerpo rígido mediante electrostática y puntuación por desolvatación. Bioinformática 29, 1698–1699 (2013).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 125-132 (2010).

McCoy, AJ y cols. Software cristalográfico Phaser. J. Appl Crystallogr 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG y Cowtan, K. Características y desarrollo de Coot. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 486–501 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DiMaio, F. y col. Refinamiento cristalográfico de baja resolución mejorado con Phenix y Rosetta. Nat. Métodos 10, 1102-1104 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeLano, WL PyMOL: una herramienta de gráficos moleculares de código abierto. Noticias CCP4. Cristalogr. de proteínas. 40, 82–92 (2002).

Google Académico

Jurrus, E. et al. Mejoras en el paquete de software de solvatación biomolecular APBS: Mejoras en el paquete de software APBS. Ciencia de las proteínas. 27, 112-128 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Waterhouse, A. et al. SWISS-MODEL: modelado por homología de estructuras y complejos proteicos. Ácidos nucleicos res. 46, W296–W303 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wimmer, R., Herrmann, T., Solioz, M. & Wüthrich, K. Estructura de RMN e interacciones metálicas de la chaperona de cobre CopZ. J. Biol. Química. 274, 22597–22603 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Baginski, ES, Foà, PP & Zak, B. Microdeterminación de fosfato inorgánico, fosfolípidos y fosfato total en materiales biológicos. Clínico. Química. 13, 326–332 (1967).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Drees, SL, Beyer, DF, Lenders-Lomscher, C. & Lübben, M. Funciones distintas de dominios de unión a metales en serie en E scherichia coli P1B -ATPasa CopA: dominios de unión a metales de CopA. Mol. Microbiol. 97, 423–438 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, EL et al. CHARMM-GUI Membrane Builder hacia simulaciones realistas de membranas biológicas. J. Computación. Química. 35, 1997-2004 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Søndergaard, CR, Olsson, MHM, Rostkowski, M. & Jensen, JH Tratamiento mejorado de ligandos y efectos de acoplamiento en el cálculo empírico y la racionalización de valores de p K a. J. química. Computación teórica. 7, 2284–2295 (2011).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Olsson, MHM, Søndergaard, CR, Rostkowski, M. & Jensen, JH PROPKA3: Tratamiento consistente de residuos internos y superficiales en predicciones empíricas de p K a. J. química. Computación teórica. 7, 525–537 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nosé, S. & Klein, ML Dinámica molecular de presión constante para sistemas moleculares. Mol. Física. 50, 1055-1076 (1983).

ADS del artículo Google Scholar

Parrinello, M. & Rahman, A. Transiciones polimórficas en monocristales: un nuevo método de dinámica molecular. J. Aplica. Física. 52, 7182–7190 (1981).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Abraham, MJ y cols. GROMACS: Simulaciones moleculares de alto rendimiento mediante paralelismo multinivel desde portátiles hasta supercomputadoras. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

ADS del artículo Google Scholar

Mejor, RB et al. Optimización del campo de fuerza de proteína de todos los átomos del aditivo CHARMM dirigido a un muestreo mejorado de los ángulos diédricos ϕ, ψ y de cadena lateral χ 1 y χ 2 de la columna vertebral. J. química. Computación teórica. 8, 3257–3273 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bozzi, AT et al. Las estructuras en múltiples conformaciones revelan distintas vías de protones y metales de transición en un transportador Nramp. Elife 8 (2019).

Descargar referencias

Los estudios de doctorado de NS fueron financiados por la Fundación Lundbeck. La beca de posdoctorado de CG fue apoyada por The BRIDGE, Programa de Excelencia Traslacional de la Universidad de Copenhague, financiado por la Fundación Novo Nordisk. CG también recibió ayuda financiera de la fundación conmemorativa del fabricante Vilhelm Pedersen y su esposa y del consorcio Aarhus Wilson. PG cuenta con el apoyo de las siguientes fundaciones: Lundbeck (R313-2019-774, R133-A12689 y R346-2020-2019), Knut y Alice Wallenberg (2020.0194 y 2015.0131), Carlsberg (CF15-0542), Novo-Nordisk (NNF13OC0007471) , Brødrene Hartmann (A29519), Agnes og Poul Friis, Augustinus (16-1992), Crafoord (20200739, 20180652 y 20170818), así como The Per-Eric y Ulla Schyberg (38267). También se obtuvo financiación del Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca (9039-00273 y 6108-00479), el Consejo Sueco de Investigación (2016-04474 y 521-2012-2243) y a través de una beca Michaelsen. GM contó con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (R35GM128704), la Fundación Robert A. Welch (AT-1935-20170325 y AT-2073-20210327) y la Fundación Nacional de Ciencias (CHE-2045984 ). MA cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación Sueco (2020-03840). Agradecemos a José M. Argüello por proporcionar el gen AfCopA y a Julie Winkel Missel por su ayuda con la preparación de liposomas. Agradecemos la ayuda con el cribado de cristales y la recopilación de datos en Swiss Light Source, el Instituto Paul Scherrer, Villigen, línea de haz X06SA. El acceso a fuentes de sincrotrón fue apoyado por el programa Danscatt del Consejo Danés de Investigación Independiente. Los cálculos se realizaron con recursos proporcionados por la Infraestructura Nacional Sueca de Computación (SNIC) a través del Centro de Computación de Alto Rendimiento Norte (HPC2N) y el Centro Nacional de Supercomputación (NSC) en el marco de los proyectos SNIC 2021/5-301, SNIC 2021/5-362. , SNIC 2022/22-441 y SNIC 2022/5-168.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Lund.

Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Copenhague, Maersk Tower 7-9, Nørre Allé 14, DK-2200, Copenhague, Dinamarca

Nina Sallustros, Christina Greenberg, Pin Lyu, Kaituo Wang y Pontus Gourdon

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Texas en Dallas, 800W Campbell Rd., Richardson, TX, 75080, EE. UU.

Nisansala S. Abeyrathna y Gabriele Meloni

Departamento de Biología, Universidad de Copenhague, Universitetsparken 13, DK-2100, Copenhague, Dinamarca

pin lyu

Departamento de Química, Universidad de Umeå, Linneaus Väg 10, SE-901 87, Umeå, Suecia

Fredrik Orädd y Magnus Andersson

Departamento de Ciencias Médicas Experimentales, Universidad de Lund, Sölvegatan 19, SE-221 84, Lund, Suecia

Ponto Gourdon

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

CG y PG iniciaron el proyecto. NS, CG y PG contribuyeron a la identificación del problema científico, la planificación experimental, el análisis de datos y la interpretación. NS y CG realizaron la clonación, sobreproducción y purificación para los estudios estructurales y funcionales, y también con la ayuda de PLNS lograron los cristales, NS y CG recopilaron datos de difracción y determinaron la estructura. KW ayudó a determinar la estructura. NS y CG refinaron las estructuras. NS ejecutó ensayos de actividad ATPasa. NA realizó mediciones ICP-MS supervisadas por GMFO y MA realizó simulaciones MD. NS preparó las figuras. NS, CG y PG escribieron el primer borrador. Todos los autores comentaron el manuscrito. CG y PG supervisaron el proyecto.

Correspondencia a Pontus Gourdon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Lin Bai y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Salustros, N., Grønberg, C., Abeyrathna, NS et al. Base estructural de la captación de iones en ATPasas tipo P1B transportadoras de cobre. Nat Comuna 13, 5121 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32751-w

Descargar cita

Recibido: 01 de marzo de 2022

Aceptado: 16 de agosto de 2022

Publicado: 31 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32751-w

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.